Forschungszentrum Borstel
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Programmbereich Infektionen

Mikrobielle Grenzflächenbiologie

Projekte

Wachstum von M. tuberculosis Clade I and Clade II in humanen Makrophagen

Im Fokus der Forschungsgruppe Mikrobielle Grenzflächenbiologie steht die detaillierte Charakterisierung der Interaktion von Mykobakterien mit ihren Zielzellen, den Makrophagen.

“To get it, all you have to do is breathe”- Die Infektion mit dem Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis erfolgt im Allgemeinen auf dem Luftweg über die Inhalation feiner Aerosole einer infizierten Person, die hustet, niest oder spricht. Das Risiko einer Infektion ist von verschiedenen Faktoren abhängig: Dazu gehören unter anderem die Infektiösität der mit Tuberkulose infizierten Person, die Enge des Kontakts mit dieser Person, die Dauer der Exposition und die lokale Belüftungssituation. Nach Inhalation kommen die Erreger in der Lunge in Kontakt mit Alveolarmakrophagen. Ob die Makrophagen vor Ort in der Lage sind den Erreger abzutöten, hängt primär von Prozessen ab, die an der Grenzfläche zwischen M. tuberculosis und  dem Makrophagen ihren Ursprung nehmen.

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass sich klinische Isolate des Mycobacterium tuberculosis Komplex (MTBC) genetisch deutlich mehr unterscheiden als bislang angenommen. In Infektionsexperimenten mit humanen primären Makrophagen und auf dem Aerosolweg infizierten Mäusen konnten wir nun Clade-spezifische Virulenz-Muster von klinischen Isolaten des MTBC identifizieren. Exklusiv human-adaptierte M. tuberculosis-Linien, die auch als Clade I oder auch als “moderne” Linien bezeichnet werden, wie z. B. Beijing und Haarlem-Isolate, zeigen im Vergleich zu Clade II-Stämmen, zu denen East-African-Indian (EAI) und M. africanum-Isolate gehören, eine signifikant erhöhte Fähigkeit in humanen Makrophagen zu wachsen. Eine einfache Korrelation zwischen der Virulenz des verwendeten MTBC Stamms und dem inflammatorischen Potential eines Isolats wurde allerdings nicht beobachtet. Unsere Daten zeigen drei unterschiedliche Pathogenitäts-Profile: (i) Beijing-Isolate sind durch eine relativ niedrige Aufnahme durch Makrophagen, eine niedrige Zytokin-Induktion sowie ein hohes Wachstumspotential charakterisiert. (ii) Stämme des Haarlem-Typs werden deutlich besser aufgenommen, induzieren deutlich mehr Zytokine, und wachsen ebenfalls besonders gut in den Makrophagen. (iii) EAI-Stämme hingegen werden ähnlich gut aufgenommen wie die Beijing-Isolate und zeigen ein sehr ähnliche, niedrige Zytokininduktion, zeigen aber ein sehr niedriges Wachtumstumspotential. Unsere Beobachtungen zeigen, dass in weiteren Untersuchungen zum Verständnis der Wirts-Pathogen-Interaktion in der Tuberkulose neben wirtsspezifischen Faktoren auch erregerspezifische Charakteristika berücksichtigt werden müssen. Reiling N, et al. MBio. 2013 Jul 30;4(4). doi:pii: e00250-13.

Magnetic-labeled mycobacteria

Pathogene Mykobakterien sind nach Aufnahme durch Makrophagen in der Lage sehr effizient die normale Reifung des sie enthaltenden Phagosoms zu verzögern und zu blockieren. Es kommt nicht zur  Fusion mit lysosomalen Kompartimenten und  der Erreger überlebt in der Zelle.  Um nun strukturelle Unterschiede zwischen unterschiedlichen MTBC Phagosomen analysieren zu können haben wir ein neues Lipid- basiertes,  immunomagnetisches Verfahren entwickelt um M. tuberculosis-enthaltende Phagosomen aus Primärzellen zu isolieren und funktionell zu charakterisieren.

Elektronenmikroskopische und biochemische Analysen der magnetischen, Phagosomen- enthaltenden Fraktion zeigten eine deutlich erhöhte Präsenz bakterieller Antigene sowie eine sich ändernde Zusammensetzung von Wirtszellfaktoren zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion. Es konnte ebenfalls eine Zytokinabhängige Änderung der Protein-Zusammensetzung des Phagosoms beobachtet werden. Durch den geringen Zeitbedarf und die Vielseitigkeit der neu entwickelten, immunomagntischen Methode lässt sich eine vergleichende biochemische  und massenspektrometrische Analyse von M. tuberculosis-enthaltenden Phagosomen (Clade I vs Clade II) durchführen. Es ist unser Ziel essentielle Faktoren und Mechanismen zu identifizieren, die für die erfolgreiche Abtötung von M. tuberculosis durch die Wirtszelle von Bedeutung sind. Da die Methodik auch geeignet ist um Phagosomen mit unterschiedlichen Erregern zu isolieren, ließen sich durch eine vergleichende Analyse dieser Kompartimente möglicherweise auch pathogen-spezifische Zielstrukturen zur Entwicklung neuer Therapiekonzepte in infektiösen Erkrankungen identifizieren. Steinhäuser C, et al. Traffic. 2013 Mar;14(3):321-36.

Expression von Wnt-6 in granulomatösen Läsionen

Durch systematische Genexpressionsanalysen Mykobakterien-infizierter Makrophagen konnten wir bereits bislang nicht bekannte Faktoren identifizieren, die einen Einfluss auf anti-mikrobielle Effektormechanismen haben: Wir und andere Arbeitsgruppen haben kürzlich erstmals regulatorische Funktionen für Komponenten des Wnt Signalwegs aufzeigen können, die für die Interaktion des  angeborenen mit dem adaptiven Immunsystem in verschiedenen entzündlichen und infektiösen Erkrankungen  wie der Tuberkulose von Bedeutung sind. Wnt-Proteine können sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Effekte auf Makrophagen und andere Zellen des Immunsystems ausüben. So konnten wir kürzlich zeigen, dass es nach Aerosol-Infektion von Mäusen mit M. tuberculosis zu einer starken Expression von Wnt6 in granulomatösen Läsionen in der Lunge kommt und dieser Faktor einen Einfluss auf die Differenzierung und auch Proliferation von Makrophagen hat

Wir konnten Schaumzell-ähnliche Makrophagen als Hauptquelle für Wnt6 in der infizierten Lunge identifizieren. Für die Induktion von Wnt6 in Makrophagen ist eine Aktivierung des TLR-MyD88-NF-kappaB-Signalwegs von Bedeutung.
Durch funktionelle Analysen in M. tuberculosis-infizierten Makrophagen unter Verwendung von Wnt6-konditioniertem Medium und Wnt6-defizienten Makrophagen konnte eine Wnt6-abhängige Induktion von Arginase-1 und eine Herabregulation von TNF-alpha aufgezeigt werden. Dies deutet auf eine unerwartete, neue Rolle für  Wnt6 in der Differenzierung und Polarisation der Zellen zu M2-Makrophagen hin. Diese Ergebnisse und die Beobachtung, dass die Mehrzahl der Wnt6-exprimierenden Makrophagen Lipidvesikel enthalten, legt die Hypothese nahe, dass M. tuberculosis Wnt6 induziert um die Bildung von Schaum-Makrophagen zu fördern, die als wichtiges zelluläres Habitat von M. tuberculosis während der Tuberkulose-Infektion beschrieben worden sind Blumenthal A et al., Blood (2006), Neumann J, et. al. The FASEB Journal  (2010), Schaale K, et al. Eur J Cell Biol. (2011), Schaale K, et al. Journal of Immunology (2013).

Zytotoxische Wirkung von anti-TB Leitstrukturen auf die Wirtszellen (primäre Makrophagen)

Unsere Expertise im Umgang mit primären Makrophagen hat uns dazu bewogen unsere in vitro Infektionsmodelle mit M. tuberculosis auch zur Testung der Effizienz neuer Anti-TB Leitstrukturen einzusetzen. Die Verbindungen werden zunächst auf ihre Wirksamkeit gegen GFP-exprimierende M. tuberculosis-Bakterien in einem neu entwickelten 96 well-basierten Medium Throughput System getestet. (Michelucci A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2013)). Dies ermöglicht uns jetzt die Analyse von kleinen und mittleren Komponenten-Bibliotheken im Hinblick auf ihre Wirksamkeit gegen M. tuberculosis. Unter Verwendung des Roche xCelligence-Systems wird dazu parallel eine mögliche zytotoxische Wirkung der Verbindungen auf die Wirtszellen (primäre Makrophagen) analysiert.  Alle drei Systeme wurden bereits erfolgreich getestet und sind Bestandteile der Preclinical test station innerhalb der Thematic Translational Transfer Unit Tuberculosis (TTU-Tb) im Deutschen Zentrum für Infektionsforschung (DZIF).